單四極桿GC-MS系統(tǒng)進行分子式測定的校正穩(wěn)定性
EI廣泛用于氣相色譜-質譜(GC-MS)，在EI過程中，分子離子常常被碎裂成多個碎片離子，盡管樣品所測得的質核比(m/z)和譜庫比較僅有±0.5 Da準確度，但這些EI碎片離子通過譜庫檢索(如NIST)可以提高MS的化合物識別能力，因此，EI譜庫檢索已經成為GC-MS化合物識別的選擇方法。雖然該方法可以很好地滿足一些日常應用，但如果很多化合物具有相似的高檢索分數(shù)時，化合物識別就變得含糊不清了。在一些苛刻應用中，如雜質和降解物識別，藥物、化學品、食品和香精、香料行業(yè)中的活性組分測定，這些不明化合物可能不在譜庫中，因此，這類應用就需要高分辨質譜系統(tǒng)如GC-TOF測量質量數(shù)，這類儀器是非常昂貴的，而且需要更高的維護費用。質量測定可以進一步確定譜庫搜索結果，或通過分子離子及重要的碎片離子確定元素組成。 在另一篇文章中，Chen及其團隊[1]報道了通過新的校正方式，精密地校正了m/z和質譜的線形譜圖，在傳統(tǒng)四極桿GC-MS系統(tǒng)上實現(xiàn)了極高的質量測定。由于這個精密設計的校正方式涉及質量準確度和譜圖準確度，關于這個校正及其實際應用的穩(wěn)定性問題隨之出現(xiàn)。 本文針對傳統(tǒng)單四極桿GC-MS系統(tǒng)元素組成識別的影響因素，質量準確度和譜圖準確度兩個方面，設計一個校正穩(wěn)定性研究程序并將結果展現(xiàn)給大家。 原理 傳統(tǒng)的質譜校正僅確定質量數(shù)，而不考慮儀器線形譜圖，儀器線形譜圖大大影響質量數(shù)測定，特別是在單位質量分辨儀器如四極桿GC-MS系統(tǒng)。開發(fā)的新校正方式[2, 3]不僅校正了質量軸，而且也校正了儀器的線形譜圖，由于質譜的理論峰位(它們是相關離子的質量和)可以非常準確的知道，另外，我們也可以準確地知道不同同位素及其豐度，通過這些信息可以計算出校正函數(shù)，不但校正峰的位置，而且也校正儀器的線形譜圖。 實際儀器的線形譜圖常常是未知且很難定義，通過這個新技術校正后，變成對稱且可用數(shù)學表達的線形函數(shù)，這就大大提高了后續(xù)處理能力，包括在單四極桿GC-MS儀器上質量數(shù)測定能力。通常來說，利用報告的質量信息，在一定的質量偏差內，通過搜索全部可能的化學分子式可以確定元素組成。依賴儀器內在的質量準確度，在質量偏差范圍內得到的分子式均為可能的分子式，如質量準確度達到1 ppm的儀器，對于500 Da的化合物，限定元素為C、H、N、O、S和Cl時，待選的化合物有34個。 眾所周知，每個分子式具有的同位素分布，理論上來說，這個同位素分布可作為分子式識別的附加信息。以前，這個方式用于分子式識別被認為是不可行的，因為很難在給定的儀器上將同位素輪廓圖校正到高于98%的譜圖準確度[4]，這就限制了使用同位素輪廓圖信息，幫助我們減少通過質量測定得到的待選化合物數(shù)量。然而，如果譜圖準確度能夠提高到99%以上，它就能在質量數(shù)得到可能分子式列表中識別出的分子式，或在不經常校正的儀器上測定確定的分子式，只要能保證相對較高的質量精度。 利用前面描述的儀器校正線形函數(shù)，列表中每個待選化合物的理論質譜圖可以準確計算出來，并將其分別與先前校正的測量質譜圖比較，高于99%的譜圖準確度值被計算出來，用于反映兩者微小且基本不同，然后對給出分子式的可能性進行排名，這個過程叫做校正的線形同位素輪廓搜索(CLIPS)，已經證明，CLIPS對于分子式測定優(yōu)于質量準確度。 實驗 全氟三丁胺(PFTBA)校正標樣和樣品混合物在Agilent 5973 GC-MS單四極桿系統(tǒng)上測試一周，PFTBA標樣通過注射法測試一次，且在一周后實驗結束時重復測試一次，混合樣品在兩次PFTBA運行中間，以不同濃度分析22次，在這個分析過程中，利用MassWorks CLIPS (Cerno Bioscience, Danbury, Connecticut)測試盲樣(名義質量數(shù)m/z 162)并確定其元素組成。PFTBA和混合樣品在相同MS條件，“raw”模式(非峰檢測，有時叫做輪廓模式)、質量范圍為50-550 m/z且離子閾值為零下采集。 利用次PFTBA運行的八個已知碎片離子，校正全部22次GC-MS運行，并計算盲樣的質量數(shù)并確定元素組成，這個校正也應用到第二次PFTBA運行，測定同樣八個碎片離子的質量，以測定兩次PFTBA運行期間的質量漂移。 結果和討論 圖1顯示了次PFTBA運行的總離子流圖，0.8 min的保留時間窗口用于校正前的譜圖平均。圖2顯示了校正離子C3F5+校正前后的輪廓模式質譜圖，表明雖然經過很好的調諧，但質譜的輪廓圖沒有已知且可定義的峰形，而校正后的譜圖具有已知且可用數(shù)學表達的峰形，校正的質譜圖也根據校正離子的單同位素質量平移到正確的質量數(shù)位置。由于慣例且不失通用性，本文中得失電子的質量差異被忽略，其正確的質量與其離子中性形式一致。
圖1. 次PFTBA校正氣運行的總離子流圖
圖2. PFTBA校正離子(C3F5+)校正前(黑)后(紅)的質譜數(shù)據 這個校正被應用在一周后的第二次PFTBA運行上，表I列出了同樣八個校正離子的質量數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)全部這些離子的系統(tǒng)質量漂移約+7 mDa，折合為12- 54 ppm，這個誤差用于傳統(tǒng)的單一同位素質量搜索確定元素組成常常認為是太大的。 表I. 后一天校正離子PFTBA數(shù)據采集處理后得到的質量數(shù)
同樣的校正應用到一周內的22次GC-MS運行，圖3畫出了m/z 162離子的質量、離子信號強度以及校正后測定出盲樣(煙堿，C10H14N2)的真實質量，該圖在質量誤差和信號強度之間展現(xiàn)了很明顯的相關性，這個結果也同文獻[5]預測和得到的結果一致。對于強度大于8000 counts，質量與真實質量的偏差在幾mDa以內，這也同表I估算的整個質量漂移一致，確定兩次PFTBA運行所觀察到的整個質量漂移程度相當于相同離子強度重復測試的隨機波動。換句話說，整個系統(tǒng)的~7 mDa質量漂移誤差，相對質量測量本身的隨機波動是沒有統(tǒng)計意義的(次PFTBA校正應用到全部22次GC-MS運行，不會造成重大的系統(tǒng)質量測量誤差)。
圖3. 報告的質量準確度、單同位素峰離子強度和已知m/z 162 Da的真實質量數(shù) 正象文獻[6]報道，當質量準確度作為分子式識別的重要工具時，通常只識別給定同位素離子的單一同位素峰，由于這個原因，即使具有1-2 ppm質量精度的高分辨質譜，在測量的很小質量誤差內，也有很多待選分子式的單一同位素質量落在這個范圍內。譜圖準確度，一個獨立計量工具，可以計量測定譜圖與計算的理論譜圖匹配程度，它包含給定離子更多的同位素分布精細結構信息，是比質量準確度更重要的信息。另外，由于代表質譜儀器線形譜圖的譜圖準確度不容易受質譜波動影響，所以譜圖準確度相對質量準確度是更可靠的分子識別工具。 162 Da的未知離子，質量誤差超過50 ppm(表I和圖3)提供了很好的例子，說明譜圖準確度相對質量準確度的相對重要性和可靠性。以162 Da離子為未知物，在通常元素C、H、N、O、F和Cl范圍內進行元素組成搜索，全部22次質譜測量利用軟件對這個離子進行處理測定它們的分子式，根據譜圖準確度排名，分子式C10H14N2排名位有19次，兩次排在第二位，一次排在第三位(圖4)，這個分子式后來證明是正確的分子式(煙堿)，排名第二和三的測量均為樣品濃度較低的情況下得到。
圖4. m/z 162(煙堿，分子式C10H14N2，真實質量為162.1157 Da)離子識別 取三次運行(24-17-12、26-18-29和31-11-40)作為例子與理論計算煙堿質譜圖進行疊加(圖5)，發(fā)現(xiàn)在低濃度運行(24-17-12)時得到好的譜圖匹配，在更高濃度運行(26-18-29和31-11-40)得到幾乎的譜圖匹配，這些都反應在相應的譜圖準確度這個度量工具上。圖5說明譜圖準確度直接同離子信號強度(噪音數(shù)據)相關，幾乎與時間或質量漂移無關，表明譜圖準確度不僅是有價值的信息，而且是更可靠的分子式識別手段。 圖5描繪了162 Da煙堿離子的質譜片斷，161 Da質譜峰與煙堿離子具有相同的離子強度，因為GC-MS和串聯(lián)MS-MS實驗中，在離子化-碎裂過程中常常有其它離子或碎片引起同位素響應疊加，這樣的質譜干擾引起162 Da離子系統(tǒng)質量測量誤差，圖3的負質量測量偏差就是充分證據。但這不會影響計算的譜圖準確度，因為m/z 161 Da離子通過構建M-H離子也被增加到CLIPS計算列表中，這里M代表需要元素組成測定的未知162 Da離子。原理上講，相似于161 Da的更多干擾離子可以處理，雖然僅可以同時處理兩個干擾離子。 雖然這里使用的單四極桿GC-MS系統(tǒng)，在一周測試期間只有7 mDa或162 Da超過50 ppm的質量波動，但對于傳統(tǒng)的質量測定元素組成會造成很大偏差，在一周的測試期間，反應質譜線形譜圖的質量準確度保持不變，不需重新校正就能不斷地進行分子式的可靠測定。 結論 穩(wěn)定性研究表明，這種通過質量準確度和譜圖準確度的精密校正的分子式識別方式不受時間波動的影響，另外，分子式測定方式通過分為質量準確度和譜圖準確度保證其可靠性。在一周測試期間，質量準確度波動約7 mDa，而質譜儀器的線形譜圖或譜圖準確度變化很小，可以不需重新校正實現(xiàn)分子式的可靠測定，這是通過利用CLIPS內置的真實同位素處理過程實現(xiàn)的，通過開發(fā)給定離子整個同位素分布的精細結構，而不是僅僅依賴單一同位素峰的質量數(shù)來實現(xiàn)的。
圖5. 校正質譜圖(紅色)與C10H14N2理論質譜圖(青色)的疊加圖(上部為天實驗、中間為兩天后實驗、底部為一周后實驗數(shù)據) 參考文獻： (1) J.P. Chen, et al., LC GC, in press. (2) M. Gu, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 764–770 (2006). (3) Y. Wang, Methods for operating mass spectrometry (MS) instrument systems, US Patent 6,983,213, Filed October 20, 2003. (4) T. Kind, BMC Bioinformatics 2006, 7,234 (www.biomedcentral.com/1471-2105/7/234). (5) K.R. Blom, Anal. Chem. 73, 715 (2001). (6) D. Kuehl, Am. Lab Online Edition, January 2008, Page 18, http://americanlaboratory.texterity.com/al-online/200801ol/?pg=18 本文引自 May 2008 Current Trends In Mass Spectrometry 25
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