馬匹中生長(zhǎng)激素濫用：IGF-1質(zhì)譜識(shí)別和定量程序的初步評(píng)價(jià)
針對(duì)賽馬中生長(zhǎng)激素（GH, 生長(zhǎng)激素）濫用的懷疑，目前已將更多的精力放到GH檢測(cè)方法上，由于其半周期小于15 min，這種激素的檢測(cè)窗口非常短，因此需要識(shí)別其它可能的次級(jí)標(biāo)記物進(jìn)行研究。研究表明，對(duì)馬或牛進(jìn)行生長(zhǎng)激素給藥后，發(fā)現(xiàn)血漿中類胰島素生長(zhǎng)因子1（IGF-1）的濃度大大提高。IGF-1是由70個(gè)氨基酸組成的、質(zhì)量數(shù)為7.5 kDa的蛋白質(zhì)，用于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，在人體和馬匹中其結(jié)構(gòu)是相似的。相對(duì)于本底濃度，對(duì)純種馬GH給藥后，IGF-1濃度大大增加的重要性進(jìn)行了研究。超過(guò)來(lái)自三個(gè)大洲的2000個(gè)賽馬（包含不同性別、年齡），對(duì)IGF-1的濃度進(jìn)行了檢測(cè)，平均濃度為310 ng/ml。通過(guò)GH處理過(guò)的受體，IGF-1大大超過(guò)其本底濃度，平均超過(guò)4倍。這清楚表明，設(shè)定IGF-1的閾值是可能的，血漿中設(shè)定在700 ng/ml左右，超過(guò)這個(gè)值，就表明GH濫用。
對(duì)于IGF-1的研究，人體中IGF-1免疫放射分析（IRMA）方法（DSL-2800, Diagnostic Systems Laboratories, Webster，TX, USA）驗(yàn)證后也適用于馬血漿的分析，表明這個(gè)可靠、耐用方法適合作為檢測(cè)馬血漿中IGF-1是否超過(guò)閾值的篩選方法。但是，馬血漿中的其它受體也可能與人類IGF-1抗體顯示某些交聯(lián)反應(yīng)，這時(shí)這種免疫診斷分析的特異性就很難進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)于GH濫用的起訴，需要更特異、更準(zhǔn)確的IGF-1定量方法，方法學(xué)上也要求證明被定量的物質(zhì)就是IGF-1，也就是具有高度的特異性。質(zhì)譜被證明特別適合于這類分析，也經(jīng)常用于檢舉和起訴的目的。
本文研究了一個(gè)LC-ESI-MS方法，用于血漿中低濃度IGF-1的定量，為了確保被定量的物質(zhì)是IGF-1，至少在部分上說(shuō)明這個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是必要的。選擇的鑒定方法，包括蛋白質(zhì)的酶解，酶解后的多肽大部分成為合適的小分子（10個(gè)氨基酸殘基或更?。?/font>。串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)（MS/MS）得到更多碎片能夠與酶解的肽結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)起來(lái)。酶解肽的色譜分離的保留時(shí)間，結(jié)合分子量，必須與IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品符合。另外，這些肽的MS/MS碎片質(zhì)譜圖也必須與期望的結(jié)構(gòu)一致，必須與IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品得到的結(jié)果一致。
與IGF-1相關(guān)的化合物，Arg3-IGF-1作為內(nèi)標(biāo)，它是市場(chǎng)上可以買到的高純度研究級(jí)蛋白質(zhì)。利用精氨酸殘基（Arg3）取代存在馬體中IGF-1的一個(gè)氨基酸殘基（Glu3）。IGF-1的多細(xì)胞抗體與這個(gè)內(nèi)標(biāo)具有高的交聯(lián)反應(yīng)，意味著可實(shí)現(xiàn)有效的親和色譜分離，由于IGF-1與Arg3-IGF-1的結(jié)構(gòu)不同，這個(gè)極性差別使HPLC分離成為可能，為IGF-1的定量提供了基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)部分 試劑 重組IGF-1（受體級(jí)）和重組Arg3-IGF-1（受體級(jí)）來(lái)自于GroPep（Adelaide, Australia）。內(nèi)源蛋白酶Glu-C（V8 蛋白酶）和內(nèi)源蛋白酶Asp-N均為測(cè)序級(jí)采購(gòu)自Roche Diagnostics（Mannheim, Germany）。乙腈和甲醇來(lái)自Riedel-de Haen（Seelze, Germany）。二硫代蘇糖醇和三氟乙酸來(lái)自Sigma（St. Louis, MO, USA），乙酸氨來(lái)自Merck（Darmstadt, Germany）。 IGF-1的內(nèi)源蛋白酶Glu-C酶解 方法參考先前使用IGF-1酶解方法。將重組IGF-1（20 ug）溶解在500 ul乙酸氨緩沖溶液（50 mM, pH 6.7）中，以1: 1（酶/底物）比例將內(nèi)源蛋白酶Glu-C加入，接下來(lái)在37℃培養(yǎng)40 h，然后加入三氟乙酸使其終濃度達(dá)到0.5%（終止酶解反應(yīng)），后將樣品保存在-8℃下。樣品僅僅在需要定性分析前進(jìn)行解凍。 IGF-1的內(nèi)源蛋白酶Asp-N酶解 下面的酶解程序基于前面描述的方法。將重組IGF-1（20 ug）溶解在500 ul乙酸氨緩沖溶液中（50 mM, pH 8.0），以1: 200（酶/底物）的比例加入Asp-N，接下來(lái)在37℃下培養(yǎng)15 h，為了減少酶解肽中的二硫鍵合，添加二硫代蘇糖醇使其濃度達(dá)到4 mM，30 min后加入三氟乙酸使其終濃度達(dá)到0.5%，后保存在-8℃條件下。樣品僅僅在需要定性分析前進(jìn)行解凍。 液相色譜 HP 1090系列II型HPLC（Palo Alto, CA, USA），每個(gè)研究使用不同的流動(dòng)相組成，這在相關(guān)的部分進(jìn)行了描述。流速為250 ul/min，在柱前利用Upchurch Scientific分流器（Oak Harbor, WA, USA）進(jìn)行分流，使進(jìn)入Jupiter C18 250 x 1 mm i.d., 5 um, 300 Å色譜柱（Phenomenex, Torrance, CA, USA）的流速為50 ul/min，色譜分離在40℃條件下進(jìn)行。 質(zhì)譜 HPLC流動(dòng)相通過(guò)ESI接口引入到Finnigan LCQ離子阱質(zhì)譜（Thermo, San Jose, CA, USA），LCQ質(zhì)譜具有MSn分析能力，利用Xcalibur軟件控制。全部分析過(guò)程的離子源電壓為4.50 kV，毛細(xì)管溫度為200℃。鞘氣氣流為60 units、輔助氣流為1 unit。離子捕獲時(shí)間手動(dòng)設(shè)定為100 ms、使用3個(gè)掃描時(shí)間段。對(duì)于MS/MS分析，母離子隔離寬度為3 Th、碰撞能為35%。 IGF-1的定性分析方法 HPLC流動(dòng)相：1%甲酸的水溶液（A）和1%甲酸的乙腈溶液（B）。梯度條件：3%B運(yùn)行5 min后，在45 min內(nèi)增加到60%，然后在5 min內(nèi)增加到90%，后保持5 min。對(duì)于兩個(gè)IGF-1酶解樣品，分別進(jìn)樣5 ul進(jìn)行分析。掃描范圍 m/z 300- 1500進(jìn)行全掃描分析，利用Pepcut功能（Xcalibur Bioworks, Thermo, San Jose, CA, USA）分析內(nèi)源蛋白酶酶解多肽的電荷狀態(tài)和質(zhì)量數(shù)。選擇每個(gè)酶解肽的豐度大的多電荷離子為母離子，進(jìn)行碰撞研究進(jìn)行MS/MS實(shí)驗(yàn)。利用Sequest軟件（Thermo Xcalibur Bioworks）測(cè)定觀察碎片和理論碎片的相關(guān)性。 IGF-1的定量分析方法 使用等度HPCL流動(dòng)相：1%甲酸水/乙腈（73: 27, v/v）。IGF-1和Arg3-IGF-1的混合樣溶解在流動(dòng)相中為校正樣，取2 ul注入HPLC，用于測(cè)試結(jié)果中ng量的指示。m/z 940- 1300的全掃描分析適用于IGF-1和Arg3-IGF-1，利用Thermo的Xcalibur Bioworks蛋白質(zhì)軟件，對(duì)多電荷蛋白質(zhì)信號(hào)進(jìn)行去卷積處理，得到質(zhì)譜的中性分子量。 結(jié)果和討論 IGF-1的定性分析方法 對(duì)于低含量的IGF-1的酶解，使用不同的水解酶并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。對(duì)蛋白的消解來(lái)說(shuō)，胰島素是常使用的。然而結(jié)果表明：酶解率低、無(wú)法識(shí)別的非特異性酶裂解。這些也能在胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶酶解方法中發(fā)現(xiàn)。氰溴酸處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)復(fù)性的低產(chǎn)率，而嗜熱菌蛋白酶酶解是不完全的。 低的酶解產(chǎn)率和非特異性酶解可能是由于IGF-1的三個(gè)二硫鍵在空間上限制了蛋白分解酶接近理論分裂位點(diǎn)。沒(méi)經(jīng)過(guò)后還原的衍生過(guò)程，可觀察到二硫鍵的重組現(xiàn)象。在接下來(lái)的研究中，利用二硫代蘇糖醇還原二硫鍵，自由巰基利用碘乙酸進(jìn)行乙酰基化，或利用次乙亞胺進(jìn)行乙氨基化，或利用乙烯基吡啶進(jìn)行吡啶亞基化衍生。在典型低濃度IGF-1的血漿中，衍生是不完全的或者IGF-1衍生物的產(chǎn)率太低，以至于不能得到需要的靈敏度，樣品也顯示了很高的質(zhì)譜分析背景。接下來(lái)研究集中在水解酶上，酶解未還原（二硫鍵未動(dòng)）的IGF-1，得到具有高產(chǎn)率的幾個(gè)酶解肽，然后未動(dòng)的二硫鍵利用后水解進(jìn)行還原。 研究采用IGF-1的內(nèi)源蛋白酶Glu-C酶解，酶作用在谷氨酸殘基的羧酸鏈進(jìn)行斷裂，利用內(nèi)源蛋白酶Glu-C對(duì)非還原的IGF-1的酶解得到7個(gè)酶解物，這些可通過(guò)全掃描LC-MS觀察到（表1）。除了預(yù)期得到的酶解產(chǎn)物，在IGF-1的Gly32、Asp12、Asp20和Asp53位羧基端的非特異、重復(fù)斷裂也能被觀察到。其中的兩個(gè)三肽，對(duì)于IGF-1僅僅給了有限的結(jié)構(gòu)信息，而另外兩個(gè)肽通過(guò)二硫鍵互相連接，正象在天然IGF-1觀察到的一樣。利用二硫代蘇糖醇處理后，含自由巰基（還原的）肽的產(chǎn)率非常低，這些物質(zhì)的MS/MS實(shí)驗(yàn)僅能得到有限的碎裂信息。
IGF-1利用內(nèi)源蛋白酶Glu-C酶解后，給出IGF-1的一些結(jié)構(gòu)信息，但這些特征仍不能滿足現(xiàn)在研究需要，因此需要利用內(nèi)源蛋白酶Asp-N對(duì)IGF-1進(jìn)行酶解，這個(gè)酶能引起天冬氨酸殘基的氨鏈斷裂，接下來(lái)通過(guò)二硫代蘇糖醇處理將二硫鍵還原。LC-MS分析表明，酶解和還原過(guò)程產(chǎn)生了7個(gè)含自由巰基的肽段，針對(duì)IGF-1序列的每個(gè)肽段，組合在一起代表了它的全序列（表2）。利用這些數(shù)據(jù)可以組建IGF-1的酶解圖（見(jiàn)圖1）?？梢钥吹皆贕lu58的氨基端具有非特異性斷裂，而在其它的Glu殘基上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，可能是由于這個(gè)位置具有更易斷裂的結(jié)構(gòu)，因此得到了兩個(gè)未預(yù)測(cè)到的肽段，肽段7是肽段6的一個(gè)Met59氧化形態(tài)。150 ng酶解的IGF-1得到的LC-MS全掃描譜圖（m/z 300- 1100）顯示了很強(qiáng)的峰（圖2a）。
IGF-1碎片峰的識(shí)別通過(guò)m/z信號(hào)相對(duì)預(yù)期得到的酶解肽段（圖2b）的重組色譜圖進(jìn)行了確認(rèn)，觀察到的多電荷離子列在表2中，圖3a和圖3b分別顯示了肽段3和肽段7的譜圖。雖然肽段1和肽段2在液相中沒(méi)有實(shí)現(xiàn)基線分離（保留時(shí)間分別為50.22和50.47 min），但他們具有不同的質(zhì)量數(shù)，因此在定量分析中不會(huì)影響結(jié)果。
就像前邊利用MS/MS檢測(cè)一樣，接下來(lái)對(duì)還原的酶解物進(jìn)行HPLC分析，對(duì)于每一個(gè)酶解肽段，雙電荷離子（或者豐度更大的多電荷離子）被選擇作為母離子，正象表2中列出的一樣。MS/MS結(jié)果對(duì)于肽段的碎裂提供豐富的信息（表3）。既然肽段3（序列20-44, 通過(guò)MS/MS得到結(jié)構(gòu)信息通常分子尺寸是太大的）分析揭示了氨基酸殘基在肽的羰基端。通過(guò)Xcalibur Bioworks Sequest軟件，觀察到的肽酶解碎片與IGF-1的理論碎片實(shí)現(xiàn)了很好的符合。肽段5和肽段1的碎片譜圖作為例子顯示在圖4a和圖4b。
IGF-1的定量分析方法
選擇Arg3-IGF-1作為內(nèi)標(biāo)用于IGF-1的定量，該化合物在結(jié)構(gòu)和分子量上與馬中的IGF-1是高度相近的，它具有70個(gè)氨基酸殘基，一個(gè)氨基酸殘基（Glu3）被精氨酸殘基（Arg3）取代。使用這個(gè)蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，是由于它在分子尺寸上與IGF-1相似，而且IGF-1的多細(xì)胞抗體同Arg3-IGF-1也有很高的交聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)使用親和色譜作為馬血漿樣品中IGF-1濃度檢測(cè)的分離條件，這點(diǎn)是非常重要的方面。設(shè)計(jì)的IGF-1定量分析LC-MS方法，包含分析該蛋白質(zhì)和未經(jīng)任何處理的內(nèi)標(biāo)物。當(dāng)分析復(fù)雜樣品時(shí)，全掃描檢測(cè)方法的選擇性使共提取物的信號(hào)排除。然而，由于Arg3-IGF-1（7675.8）和IGF-1（7648.8）非常相近的分子量，這些蛋白的多電荷形式更加接近，因此這兩個(gè)蛋白的色譜分離非常重要。由于內(nèi)標(biāo)在Arg3鏈端具有一個(gè)自由氨基（而IGF-1沒(méi)有），因此這兩個(gè)蛋白具有不同的極性。這個(gè)特點(diǎn)可通過(guò)反相HPLC進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)了這兩個(gè)相似化合物的基線分離，Arg3-IGF-1和IGF-1的保留時(shí)間分別為2.7 min和4.9 min。
這些蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖顯示了6和8質(zhì)子化作用（6-8個(gè)正電荷），強(qiáng)峰是[M+7H]7+，觀察到IGF-1的質(zhì)核比是m/z 1093.4（理論值 m/z 1093.5），Arg3-IGF-1的質(zhì)核比是m/z 1097.2（理論值 m/z 1097.5）。這些蛋白的質(zhì)量數(shù)通過(guò)軟件的去卷積選項(xiàng)進(jìn)行了確認(rèn)。為了定量，選擇m/z 940- 1300的掃描范圍，譜圖包含了[M+6H]6+、[M+7H]7+和[M+8H]8+物質(zhì)的信號(hào)，確認(rèn)這些峰確實(shí)是IGF-1和內(nèi)標(biāo)的信號(hào)。m/z 1093.4 (±0.5)和1097.2 (±0.5)的信號(hào)分別被選擇用于IGF-1和內(nèi)標(biāo)的定量。IGF-1在30- 500 ng（柱上濃度）濃度范圍內(nèi)，利用IGF-1/內(nèi)標(biāo)的比例、內(nèi)標(biāo)濃度為200 ng（柱上濃度），得到了很好的線性，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9974（n=6），見(jiàn)圖5a和圖5b。定量限（LOQ）在柱上濃度為30 ng時(shí)進(jìn)行了測(cè)試，即使在這么低的濃度下，也可觀察到IGF-1和內(nèi)標(biāo)物高度特征譜圖（見(jiàn)圖5c和圖5d）。更低濃度的線性沒(méi)有進(jìn)行測(cè)試。應(yīng)用這個(gè)方法用于馬血漿中IGF-1的定量成為目前研究的基礎(chǔ)。
結(jié)論
本文開發(fā)了用于IGF-1定量的物質(zhì)確定識(shí)別、IGF-1的定量方法。這包括在低濃度未還原（二硫鍵完好）IGF-1的酶解方法選擇，為了得到自由巰基的酶解肽段，接下來(lái)進(jìn)行酶解后還原這些二硫鍵。IGF-1利用內(nèi)源蛋白酶Asp-N酶解后，接下來(lái)利用這種方式還原，然后進(jìn)行全掃描LC-MS分析，可得到高度特征的色譜和質(zhì)譜指紋譜圖。為了清晰起見(jiàn)，給出了柱上濃度為150 ng（IGF-1）的分析結(jié)果，但濃度為20 ng得到的數(shù)據(jù)也很容易被解析。由于非特異的酶解反應(yīng)，觀察到兩個(gè)酶解肽段，一個(gè)肽段也在蛋氨酸氧化態(tài)形式額外觀察到，酶解肽段和預(yù)測(cè)的肽段是不一致的。酶解肽段的ESI-LC-MS/MS分析，表明得到的碎片與理論碎片（通過(guò)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)生）具有很好的一致性。正確酶解肽段的關(guān)聯(lián)技術(shù)，結(jié)合這些肽段的期望碎片，樣品和IGF-1能被看作高度特異的識(shí)別方法。
開發(fā)了一個(gè)ESI-MS全掃描方法用于低濃度IGF-1的定量，使用Arg3-IGF-1作內(nèi)標(biāo)，在柱上濃度為30 ng（LOQ）到500 ng之間，得到了很好的線性。全掃描代替選擇離子監(jiān)測(cè)用于IGF-1和內(nèi)標(biāo)的定量，這不僅通過(guò)色譜保留時(shí)間，也通過(guò)特征的電噴霧質(zhì)譜多電荷離子形式，使這些物質(zhì)識(shí)別成為可能。
這個(gè)初級(jí)研究描述的方法，正被應(yīng)用于馬血漿中IGF-1的濃度檢測(cè)。IGF-1的濫用閾值設(shè)定在700 ng/ml左右，并得到幾毫升馬血漿樣品，這個(gè)方法很適用于IGF-1的高靈敏度定性與定量分析。
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